Функції рестрикційних ферментів, механізм дії, типи та приклади



The рестрикційні ферменти вони є ендонуклеазами, які використовуються певними археями і бактеріями для придушення або "обмеження" поширення вірусів всередині них. Вони особливо часто зустрічаються у бактерій і є частиною їх системи захисту від чужорідної ДНК, відомої як система обмеження / модифікації.

Ці ферменти каталізують різання дволанцюжкової ДНК на певних ділянках, відтворювально і без використання додаткової енергії. Більшість вимагають присутності кофакторів, таких як магній або інші двовалентні катіони, хоча деякі також вимагають АТФ або S-аденозил метіоніну.

Рестрикційні ендонуклеази були виявлені в 1978 році Даніелем Натаном, Арбером Вернером і Гамільтоном Смітом, які отримали Нобелівську премію з медицини за їх відкриття. Його назва зазвичай походить від організму, де вони спостерігаються вперше.

Такі ферменти широко використовуються у розробці методів клонування ДНК та інших стратегій молекулярної біології та генної інженерії. Її характеристики розпізнавання конкретних послідовностей і здатність розрізати послідовності, близькі до сайтів розпізнавання, роблять їх потужними інструментами в генетичних експериментах.

Фрагменти, створені ферментами рестрикції, які діяли на конкретну молекулу ДНК, можуть бути використані для відтворення "карти" вихідної молекули, використовуючи інформацію про місця, де фермент розрізав ДНК.

Деякі рестрикційні ферменти можуть мати однаковий сайт розпізнавання в ДНК, але вони не обов'язково розрізають його таким же чином. Таким чином, існують ферменти, які роблять розрізи, що залишають тупі кінці, і ферменти, які розрізають, залишаючи когезивні кінці, які мають різні застосування в молекулярній біології.

В даний час існують сотні різних комерційно доступних ферментів рестрикції, пропонованих різними комерційними будинками; ці ферменти працюють як "звичайні" молекулярні ножиці для різних цілей.

Індекс

  • 1 Функції
  • 2 Механізм дії
  • 3 типи
    • 3.1 Рестрикційні ферменти І типу
    • 3.2 Рестрикційні ферменти типу II
    • 3.3 Рестрикційні ферменти типу III
    • 3.4 Рестрикційні ферменти типу IV
    • 3.5 Рестрикційні ферменти типу V
  • 4 Приклади
  • 5 Посилання

Функції

Рестрикційні ферменти служать протилежній функції полімераз, оскільки вони гідролізують або розривають складноефірні зв'язки в фосфодіефірній зв'язку між сусідніми нуклеотидами в нуклеотидної ланцюга..

У молекулярній біології та генній інженерії вони широко використовуються засоби для побудови векторів експресії та клонування, а також для ідентифікації конкретних послідовностей. Вони також корисні для побудови рекомбінантних геномів і мають великий біотехнологічний потенціал.

Недавні досягнення в генній терапії в даний час використовують рестрикційні ферменти для введення певних генів у вектори, які є засобами транспортування таких генів до живих клітин, і які, ймовірно, мають здатність вставлятися в клітинний геном для виконання постійних змін.

Механізм дії

Рестрикційні ферменти можуть каталізувати різання дволанцюжкової ДНК, хоча деякі здатні розпізнавати одноланцюгові ДНК-послідовності і навіть РНК. Розріз відбувається після розпізнавання послідовностей.

Механізм дії полягає в гідролізі фосфодіефірного зв'язку між фосфатною групою і дезоксирибозой в остові кожної нитки ДНК. Багато ферментів здатні скорочуватися в тому ж місці, в якому вони розпізнаються, а інші вирізають між 5 і 9 парами до або після неї..

Зазвичай ці ферменти розрізають на 5'-кінці фосфатної групи, даючи фрагменти ДНК з 5'-фосфорильним кінцем і кінцевим 3'-гідроксильним кінцем..

Оскільки білки не вступають в прямий контакт з ділянкою розпізнавання в ДНК, вони повинні бути послідовно переміщені, поки вони не досягнуть конкретного місця, можливо, за допомогою "ковзних" механізмів на ланцюзі ДНК..

Під час ферментативного розрізу фосфодіефірна зв'язок кожної з ниток ДНК розташовується в межах одного з активних центрів рестрикційних ферментів. Коли фермент залишає ділянку розпізнавання і розрізання, він робить це через неспецифічні перехідні асоціації.

Типи

В даний час відомі п'ять типів рестрикційних ферментів. Нижче наведено короткий опис кожного з них:

Рестрикційні ферменти І типу

Ці ферменти являють собою великі пентамерні білки з трьома субодиницями, рестрикцію, метилювання та інше для розпізнавання послідовностей в ДНК. Ці ендонуклеази є багатофункціональними білками, здатними каталізувати реакції рестрикції та модифікації, вони мають АТФазну активність, а також ДНК-топоізомеразу.

Ферменти цього типу були першими ендонуклеазами, які були виявлені, вони були очищені вперше в 1960-х роках і з тих пір вони були вивчені з великою глибиною..

Ферменти типу I не використовуються широко як біотехнологічний інструмент, оскільки ділянка різання може перебувати на змінному відстані до 1000 пар основ від місця розпізнавання, що робить їх ненадійними з точки зору експериментальної відтворюваності.

Ферменти рестрикції II типу

Це ферменти, що складаються з гомодимерів або тетрамерів, які розрізають ДНК на певних ділянках довжиною від 4 до 8 bp. Ці ділянки різання зазвичай є палиндромними, тобто вони розпізнають послідовності, які зчитуються таким же чином в обох напрямках.

Багато з ферментів рестрикції II типу в бактеріях розрізають ДНК, коли вони розпізнають свій чужий характер, оскільки вони не мають типових модифікацій, які повинна мати власна ДНК..

Це найпростіші рестрикційні ферменти, оскільки вони не вимагають іншого кофактора, крім магнію (Mg +), для розпізнавання та розрізання послідовностей ДНК..

Точність рестрикційних ферментів типу II у розпізнаванні та різанні простих послідовностей в ДНК в точних положеннях робить їх одним з найбільш використовуваних і незамінних у більшості галузей молекулярної біології.

У групі типів II ферментів рестрикції є декілька підкласів, класифікованих за певними властивостями, які є унікальними для кожного з них. Класифікація цих ферментів здійснюється шляхом додавання букв алфавіту, від А до Я, за назвою ферменту..

Деякі з підкласів, найбільш відомих своєю корисністю, такі:

Підклас IIA

Вони є димерами різних субодиниць. Вони розпізнають асиметричні послідовності і використовуються в якості ідеальних попередників для генерації ферментів різання.

Підклас IIB

Вони складаються з ще одного димера і розрізають ДНК з обох сторін послідовності розпізнавання. Вони розрізають обидві нитки ДНК в діапазоні пар основ поза межами місця розпізнавання.

Підклас IIC

Ферменти цього типу є поліпептидами з функціями поділу і модифікації ниток ДНК. Ці ферменти ріжуть обидві нитки асиметрично.

Підклас IIE

Ферменти цього підкласу найбільш часто використовуються в генній інженерії. Вони мають каталітичний сайт і зазвичай вимагають аллостеричний ефектор. Ці ферменти повинні взаємодіяти з двома копіями своєї послідовності розпізнавання, щоб зробити ефективний розріз. В межах цього підкласу знаходяться ферменти EcoRII і EcoRI.

Рестрикційні ферменти типу III

Ендонуклеази рестрикції типу III складаються тільки з двох субодиниць, одна відповідає за розпізнавання і модифікацію ДНК, а інша відповідає за розрізання послідовності.

Ці ферменти потребують двох кофакторів для їх функціонування: АТФ і магнію. Рестрикційні ферменти цього типу володіють двома асиметричними ділянками розпізнавання, переміщують ДНК за допомогою АТФ-залежного способу і розрізають її між 20 і 30 п.н..

Резистентні ферменти типу IV

Ферменти типу IV легко ідентифікувати, оскільки вони режуть ДНК метилаційними мітками, вони складаються з декількох різних субодиниць, які відповідають за розпізнавання і розрізання послідовності ДНК. Ці ферменти використовують в якості кофакторів GTP і двовалентного магнію.

Конкретні ділянки для різання включають нуклеотидні ланцюги з залишками метильованого або гідроксиметилированного цитозина в одній або обох ланцюгах нуклеїнових кислот..

Рестрикційні ферменти типу V

Ця класифікація об'єднує ферменти типу CRISPER-Cas, які ідентифікують і розрізають специфічні послідовності ДНК від вторгаючих організмів. Cas ферменти використовують нитку CRISPER синтезованих керівних РНК для розпізнавання і атаки вторгаються організмів.

Ферменти, класифіковані як тип V, є поліпептидами, структурованими ферментами типу I, II і II. Вони можуть вирізати ділянки ДНК практично будь-якого організму і з великим діапазоном довжини. Їхня гнучкість і легкість у використанні роблять ці ферменти одним з найбільш часто використовуваних інструментів у генній інженерії сьогодні разом з ферментами типу II..

Приклади

Для виявлення поліморфізмів ДНК використовували рестрикційні ферменти, особливо в дослідженнях популяційної генетики та еволюційних досліджень з використанням мітохондріальної ДНК, щоб отримати інформацію про швидкості заміни нуклеотидів..

В даний час вектори, що використовуються для трансформації бактерій з різними цілями, мають мультиклональние ділянки, де знайдені сайти розпізнавання для декількох ферментів рестрикції..

Серед цих ферментів найбільш популярними є EcoRI, II, III, IV і V, отримані і описані вперше. E. coli; HindIII, від H. influenzae і BamHI's B. amyloliquefaciens.

Список літератури

  1. Bickle, T.A., & Kruger, D.H. (1993). Біологія рестрикції ДНК. Мікробіологічні огляди, 57(2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D.A., & Horvath, P. (2007). CRISPR Забезпечує набутий опір проти вірусів у прокаріотів. Наука, 315(Березень), 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). Молекулярна перспектива: рестрикційні ендонуклеази. Основи клітин ракової медицини, 20, 190-191.
  4. Halford, S.E. (2001). Підстрибування, стрибки і циклічність за допомогою рестрикційних ферментів. Угоди про біохімічне товариство, 29, 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). Підтримання видової ідентичності та контроль видоутворення бактерій: нова функція для систем обмеження / модифікації? Ген, 317, 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Геви Левіна XII (12 изд.). Берлінгтон, штат Массачусетс: Jones & Bartlett Learning.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... She, Q. (2015). Використання CRISPR-Cas систем типу I та III для редагування геному. Дослідження нуклеїнових кислот, 1-12.
  8. Loenen, W.A.M., Dryden, D.T.F., Raleigh, E.A., & Wilson, G.G. (2013). Ферменти рестрикції I типу та їх родичі. Дослідження нуклеїнових кислот, 1-25.
  9.  Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Рестрикційні ендонуклеази в аналізі і перебудові молекул ДНК. Анну. Biochem., 273-293.
  10.  Nei, M., & Tajima, F. (1981). Поліморфізм ДНК, виявляється эндонуклеазами рестрикції. Генетика, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Ендонуклеази рестрикції клітинного типу та молекулярних наук типу II: структура та механізм. CMLS Клітинні та молекулярні науки про життя, 62, 685-707.
  12.  Робертс, Р. (2005). Як ферменти рестрикції стали робочими конями молекулярної біології. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Roberts, R. J., & Murray, K. (1976). Рестрикційні ендонуклеази. Критичні відгуки в біохімії, (Листопад), 123-164.
  14.  Стоддард, Б. Л. (2005). Структура і функція ендонуклеази. Щоквартальні огляди біофізики, 1-47.
  15.  Tock, M. R., & Dryden, D.T.F. (2005). Біологія рестрикції і анти-обмеження. Актуальне думка в мікробіології, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16.  Wilson, G. G., & Murray, N.E. (1991). Системи обмеження та модифікації. Анну. Genet., 25, 585-627.
  17.  Wu, Z. & Mou, K. (2016). Геномне розуміння вірулентності Campylobacter jejuni і популяційної генетики. Заражає Дис. Transl. Med., 2(3), 109-119.
  18.  Yuan, R. (1981). Структура і механізм багатофункціональних рестрикційних ендонуклеаз. Анну. Biochem., 50, 285-315.