Характеристика та підготовка бактеріального мазка
The бактеріальний мазок є розширенням у вигляді тонкої плівки суспензії бактеріальних мікроорганізмів, яка здійснюється на прозорій скляній пластині або предметних стеклах, для спостереження під оптичним мікроскопом.
Розширення у вигляді плівки здійснюється для того, щоб максимально відокремити мікроорганізми, оскільки, якщо вони згруповані, спостереження не є чітким.
При вивченні бактеріальних культур використовуються методики підготовки мазка, фіксації та забарвлення для їх кращого аналізу. Через малий розмір мікроорганізмів для його спостереження обов'язково потрібно використовувати оптичний мікроскоп.
Оптичні мікроскопи є незамінними інструментами для спостереження за мазками. Вони використовують оптичні лінзи і світло, що дозволяє візуалізувати зразки з великим збільшенням розмірів.
Взагалі, живі клітини не мають структур, які в основному забарвлені, проглядаються через оптичний мікроскоп, вони є безбарвними, прозорими зразками і демонструють дуже малий внутрішній контраст і з оточенням.
Спостереження з простим світловим полевим мікроскопом, без використання допоміжних методів фарбування, дуже обмежене і використовується лише в деяких випадках, як при спостереженні руху мікроорганізмів..
Для оптимального спостереження мікроорганізмів необхідно досягти балансу між контрастом і роздільною здатністю. Деталі клітин не можуть спостерігатися під мікроскопом, навіть при високому дозволі; використання барвників потрібно за допомогою методів фарбування, які забезпечують контраст для спостереження.
Індекс
- 1 Характеристика хорошого бактеріального мазка
- 1.1 Відмінна контрастність
- 1.2 Хороша фіксація
- 1.3 Гарне фарбування
- 2 Підготовка
- 2.1 A. Frotis
- 2.2 Фіксація
- 2.3 C. Просте фарбування
- 2.4 D. Остаточне збереження мазка
- 3 Посилання
Характеристики хорошого бактеріального мазка
Відмінна контрастність
Для досягнення відмінного контрасту називають складні мікроскопи мікроскоп фазового контрасту, диференціальна інтерференція і мікроскоп темного поля. Цей тип мікроскопа використовується для спостереження бактеріальних структур, таких як оболонки і нитки, серед інших.
Фарбування являє собою просту техніку для збільшення контрасту, що досягається за допомогою ясного поля мікроскопа. У цій техніці можна використовувати різні барвники, які помітно покращують спостереження під мікроскопом.
Забарвлення проводиться безпосередньо на мазках або розширеннях суспензій мікроорганізмів на предметних стеклах, попередньо висушених і закріплених.
Хороша фіксація
Фіксація - це техніка, яка використовується для збереження клітинних структур; викликає інактивацію мікроорганізмів і адгезію до склянки слайда. Існують різні процедури фіксації: фіксація тепла і хімічна фіксація.
Фіксація тепла
Саме цей метод найчастіше використовується при спостереженні бактеріального мазка. Методика полягає в пропущенні бактеріальної суспензії мазка полум'ям. Ця методика здатна зберігати зовнішню морфологію бактерій, але руйнує їхні внутрішні структури.
Хімічна фіксація
Хімічна фіксація використовує хімічні речовини в консервації, такі як формальдегід або формальдегід, етанол і оцтова кислота, серед інших. Перевага використання хімічних фіксуючих агентів полягає в тому, що досягається збереження внутрішніх клітинних структур мікроорганізмів.
Гарне фарбування
Найбільш поширені процедури фарбування попередньо висушеного і фіксованого мазка - це позитивне або просте фарбування, диференційне фарбування і негативне фарбування. Існують також спеціальні методики для фарбування окремих клітинних структур (капсули, спори, джгутики).
Позитивне фарбування або просте фарбування
Позитивне або просте фарбування є найбільш використовуваним методом мазка плями. Використовують барвники, які мають здатність зв'язуватися з певними мікробними структурами, дозволяючи їх спостерігати під мікроскопом.
Ці барвники мають хромофорні групи (забарвлену частину) за своєю хімічною структурою, з чергуючими подвійними зв'язками і простими зв'язками (кон'югацією). Ці зв'язки можуть в свою чергу встановлювати іонні або ковалентні зв'язки з деякими клітинними структурами.
Барвники, що використовуються в позитивному або простому фарбуванні, є переважно хімічними похідними анілін (кольорові органічні солі).
З іншого боку, серед барвників ми можемо знайти деякі з основним рН та інші з кислотним рН.
Основні барвники
У основних барвниках хромофорная група має позитивний електричний заряд. Переважна більшість прокариотических мікроорганізмів мають нейтральний внутрішній рН, і їх клітинна поверхня негативно заряджена. Через це електростатичне взаємодія, хромофор зв'язується з кліткою і фарбує її.
Прикладами основних барвників є метиленовий синій, фіолетовий кристал, малахіт зелений, основний фузин, сафранін.
Кислі барвники
У кислотних барвниках хромофорная група має негативний електричний заряд. Вони використовуються для фарбування білків позитивно зарядженими аміногрупами. Прикладами кислотних барвників є кислота фузин, троянда бенгальська, конго-червона і еозин.
Диференціальне фарбування
Техніка диференціального фарбування полягає у застосуванні двох барвників різного кольору або інтенсивності, щоб розрізнити різні мікроорганізми під мікроскопом. Грам забарвлення і кислотно-спиртовий стійкість фарбування є найбільш використовуваними диференційними плямами в бактеріології.
Забарвлення по Граму використовується в якості попереднього тесту для знання форми, розміру, групування клітин, крім типу клітинної стінки. За допомогою тесту на забарвлення Gram бактерії з клітинною стінкою класифікуються як грампозитивні бактерії та грамнегативні бактерії.
Негативне фарбування
У цій техніці використовуються хімічні барвники, які не проникають до клітинного інтер'єру, але вони роблять те середовище, в якій мікроорганізми з'являються як чорний фон.
У техніці негативного фарбування мазок виробляється краплею суспензії китайської фарби або нігрозину, яка після дозволу сушіння при кімнатній температурі утворює плівку непрозору для проходження світла. Таким чином, мікроорганізми спостерігаються як яскраві форми на темному тлі.
Підготовка
A. Мазок
1.- Промийте слайди дуже добре, висушіть абсорбуючою папером і позначте їх. На етикетці повинні бути зазначені зміст препарату, дата і назва особи, яка її обробив.
2. - Запаліть запальничку і стерилізуйте петлю для інокуляції у полум'я, доки вона не стане червоною.
3.- Дайте ручці охолонути.
4. - Візьміть пробірку бактеріальної культури, зніміть ковпачок і швидко пропустіть рот трубки біля полум'я запальнички (полум'я).
5. Ввести петлю для інокуляції всередині трубки, що містить бактеріальну культуру, і взяти зразок.
6. Якщо культура знаходиться в рідкому середовищі, помістіть зразок, взятий з ручкою в центрі слайда, і розкладіть його обережно в колі діаметром приблизно 2 см.
7.- Повторно стерилізувати петлю інокуляції.
8.- Дозволити висушування мазка на повітрі.
9.- Повторіть кроки від 3 до 8 тричі.
10. Якщо культура знаходиться в твердій середовищі, краплю дистильованої води слід попередньо помістити на предметне скло. Це робиться для змішування невеликої проби культури, взятої з ручкою інокуляції, згідно з показаннями етапів 2 - 5 (умови асептики).
11.- Витягніть розведений зразок з краплею води на предметне скло і повторіть тричі.
B. Фіксація
1.- До сухого мазка, отриманого з культур у рідкому середовищі, додають дві краплі метанолу або абсолютного етанолу..
2.- Дайте висихання на повітрі подалі від запальнички.
3. Якщо мазок походить з культури в твердому середовищі, сухий мазок фіксується теплом, пропускаючи його 2 - 3 рази швидко через найгарячішу область полум'я запальнички..
4. - Доторкніться до нижньої частини мазка дорзальною частиною лівої руки (за праву руку, інакше використовуйте праву руку) і перевірте, що вона холодна.
Просте фарбування
1. Додайте 2 краплі виділеного барвника до мазка і дайте йому діяти протягом часу, необхідного для конкретних протоколів кожного барвника (зазвичай від 1 до 5 хвилин)..
Деякі барвники вимагають використання тепла для їх активації, в цьому випадку необхідно бути дуже обережним при нагріванні ковзання в полум'ї запальнички (маніпулювати його пінцетом і уникати кипіння). Перегрів мазка може знищити клітини, які ви хочете спостерігати.
3.- Видаліть зайвий барвник, промивши дистильованою водою з пікет. Зніміть промивну воду, обережно постукуючи по краю, нахилившись на робочий стіл.
4.- Дозволити сушку на повітрі.
5.- Залежно від типу спостереження, на цьому етапі використовується або не використовується покривне скло. Покривало захищає і зберігає мазок. Якщо на цій стадії проводиться спостереження за допомогою занурення в нафту, то не використовується покривне скло, але мазок не може бути збережений.
D. Остаточне збереження мазка
1. Послідовно занурюйте мазок у кожне з зазначених нижче розчинів протягом мінімум 5 хвилин. Мета цих "ванн" полягає в тому, щоб залишити мазок повністю зневодненим. Кожен реагент необхідно злити, перед введенням мазка в наступну ванну.
Порядок дегідратаційних ванн наступний:
- Етанол 70%
- 95% етанол
- Чистий ацетон
- Змішують ацетон-ксилол 1: 1
- Xilol
Потім дають можливість сушіння на повітрі.
2.- Монтуйте кришку, переважно 22 × 22 мм, використовуючи канадський бальзам або інші засоби складання.
Список літератури
- Briggs, G. (1965). Причинно-наслідкові фактори в мікробіологічних аваріях та інфекціях лабораторій. Біологічні лабораторії армії США. Форт-Детрік.
- Cappucino, J.G. і Welch, C.T. (2017). Мікробіологія: Навчальний посібник. Пірсон.
- Holt, J.G. Редактор (1977). Короткий посібник з детермінативної бактеріології Берджи. 8й Балтімор: Вільямс і Уілкінс Ко.
- Johnson, T.R. і Case; C.L. (2018). Лабораторні експерименти в мікробіології. Пірсон.
- Tille, P. (2017). Діагностична мікробіологія. 14й Сент-Луїс, США: Elsiever, Inc.