Основа, приготування та використання бульйону з сечовиною

The бульйон сечовини являє собою рідку культуральне середовище, що використовується для демонстрації присутності ферменту уреази в певних мікроорганізмах. Уреаза являє собою мікробний фермент, який виробляється конститутивно, тобто він синтезується незалежно від того, чи є субстрат, на якому він діє, чи ні.

Функція уреази пов'язана з розкладанням органічних сполук. Не всі мікроорганізми здатні синтезувати цей фермент, тому його визначення в лабораторії дозволяє виявити певні бактеріальні штами і навіть диференціювати види одного і того ж роду..

Існує два типи тесту сечовини: Стюарт і Крістенсен. Вони відрізняються своїм складом і чутливістю. Перший особливий, щоб показати велику кількість уреази, виробленої видами роду Proteus.

Другий є більш чутливим і може виявити невеликі кількості уреази, виробленої пізніше іншими бактеріальними родами, такими як Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter та Mycobacterium.

Бульйон Stuart сечовини складається з сечовини, хлориду натрію, фосфату дикалия, фосфату монокалію, екстракту дріжджів, фенолового червоного і дистильованої води.

В той час як бульйон Christensen або сечовина агару складається з пептонів, хлориду натрію, фосфату монокалію, глюкози, сечовини, фенолового червоного, дистильованої води і агаро-агару. Останній тільки в тому випадку, якщо це тверда середовище.

Індекс

• 1 Фонд
  • 1.1 Стюартний бульйон сечовини
  • 1.2. Крістенсенний бульйон або агаровий карбамід
  • 1.3 Інтерпретація обох засобів масової інформації (Стюарт і Крістенсен)
• 2 Підготовка
  • 2.1 Стюартний бульйон сечовини
  • 2.2 Бульйон Крістенсена або сечовину агару
• 3 Використання
• 4 Посів тесту сечовини
• 5 Контроль якості
• 6 Посилання

Фонд

Фермент уреаза гідролізує сечовину з утворенням вуглекислого газу, води і двох молекул аміаку. Ці сполуки реагують, утворюючи кінцевий продукт, названий карбонатом амонію.

Стюарт бульйон сечовини

Бульйон Стюарта з сечовиною більш буферний з рН 6,8. Таким чином, мікроорганізм повинен бути здатний утворювати великі кількості амонію, щоб стати червоним до фенолу. PH повинен піднятися вище 8.

Тому бульйон Стюарта з сечовиною є селективним для видів Proteus, даючи позитивні результати за 24 до 48 годин інкубації, і не є ефективним для бактерій, які продукують низькі кількості уреази або повільно гідролізують сечовину.

Це пояснюється тим, що види Proteus здатні використовувати сечовину як джерело азоту. Навпаки, інші бактерії, що продукують уреазу, потребують додаткового джерела.

Однак Pérez et al. (2002) визначили, що бульйон Стюарта сечовини був настільки ж ефективним, як агар сечовини від Christensen, для визначення уреази в штамах дріжджів родів Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon і Saccharomyces..

Автори дослідження стверджують, що досягли 100% збігу з обома засобами (Stuart і Christensen) шляхом інкубації протягом 24 і 48 годин; за умови, що вони сприйняли як позитивні штами, які вдалося перетворити носій на сильний рожево-фуксійний колір.

Це роз'яснення є необхідним, оскільки Lodder (1970) стверджував, що майже всі дріжджі встигають помістити скос сечового агару Christensen до блідо-рожевого кольору. Це пояснюється тим, що вони можуть гідролізувати сечовину в мінімальних кількостях, а також утворювати аміни шляхом окисного декарбоксилювання амінокислот на поверхні. Це не слід тлумачити як позитивне.

Відвар або агар з сечовини від Christensen

Бульйон з сечовиною Christensen або агар менш буферні, що дозволяє виявляти невеликі кількості амонію. Крім того, це середовище збагачується пептонами і глюкозою. Ці сполуки викликають розвиток інших мікроорганізмів, що продукують уреазу, які не ростуть в бульйоні Стюарт.

Аналогічно, тест на сечовину Christensen забезпечує більш швидкі результати, особливо для Proteus, здатні дати дуже позитивні результати лише за 30 хвилин як мінімальний час і до 6 годин як максимальний час..

Решту мікроорганізмів, що продукують уреазу, вдалося злегка перетворити колір середовища через 6 годин, і сильно через 24, 48, 72 години або більше, і навіть деякі штами можуть давати слабкі реакції через 5 або 6 днів.

Інтерпретація обох ЗМІ (Стюарт і Крістенсен)

Середа спочатку жовто-оранжевого кольору і позитивна реакція перетворить колір середовища на рожеву-фуксію. Інтенсивність кольору прямо пропорційна кількості продукованого амонію.

Негативна реакція залишає середовище вихідного кольору, за винятком дріжджів, які можуть дати блідо-рожевий з сечовиновим агаром Christensen.

Підготовка

Стюарт бульйон сечовини

Зважте необхідні грами за показаннями комерційного будинку. Розчиняють у переважно стерильній дистильованій воді. Не використовуйте тепло для розчинення, оскільки сечовина чутлива до тепла.

Метод мембранної фільтрації використовується для стерилізації. Для цього використовується фільтр Millipore з порами діаметром 0,45 мкм. Не використовуйте автоклав. Як тільки розчин фільтрується, він розподіляється в стерильних пробірках. Для отримання достовірних результатів необхідно перенести від 1,5 мл до мінімальної кількості до 3 мл як максимальну кількість на пробірку..

Зберігати в холодильнику і зберігати перед використанням.

Якщо метод фільтрації недоступний, середовище слід використовувати негайно для отримання надійних результатів.

Інший спосіб приготування бульйону сечовини Stuart полягає в наступному:

Деякі комерційні будинки продають половину бази для випробування на сечовину, не включаючи сечовину.

Сума, зазначена комерційним будинком, зважується. Його розчиняють у дистильованій воді і стерилізують в автоклаві при 121 ° С протягом 15 хвилин. Дайте їй трохи відпочити, а коли середовище нагріється, додайте 100 мл розчину сечовини, приготованого за 20%, і стерилізуйте фільтруванням.

Він розподіляється в стерильних пробірках, як описано раніше.

Відвар або агар з сечовини від Christensen

-Приготування розчину сечовини

Зважують 29 грамів збезводненої сечовини і розчиняють у 100 мл дистильованої води. Використовуйте метод фільтрації для стерилізації. Не автоклавувати.

-Агар на основі карбаміду

Розчиняють 24 г зневодненого основного агару в 950 мл дистильованої води. Стерилізувати в автоклаві при 121 ° С протягом 15 хвилин. Дайте витримати, поки вона не досягне температури 50 ° C і додати попередньо підготовлену сечовину асептично.

Залийте 4 до 5 мл в стерильні пробірки і нахиліть до твердіння. Має бути довгий пік флейти.

Ця середовище також може бути приготована в рідкій формі.

Використання

Тест на сечовину є надзвичайно ефективним у виділенні роду Proteus від інших родів родини Enterobacteriaceae, враховуючи швидку реакцію, яку надає Proteus.

Якщо використовується композиція Christensen, тест допомагає диференціювати види одного роду. Наприклад, S. haemolyticus і S. warneri sна Стафілокок коагулаза негативна і бетагемолітична, але вони відрізняються тим S. haemolyticus це негативна сечовина і S. warneri це позитивна сечовина.

З іншого боку, McNulty успішно використав 2% бульйону з сечовиною Christensen для вивчення присутності Helicobacter pylori у зразках біопсій, узятих із слизової оболонки шлунка (антральна область).

Наявність H. pylori про це свідчить позитивний тест на сечовину. Тривалість спостереження за результатами прямо пропорційна кількості наявних мікроорганізмів.

Як видно, це простий метод діагностики Helicobacter pylori в біопсіях шлунка.

Нарешті, цей тест також корисний для диференціації видів родів Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus і Mycobacteria.

Посів тесту сечовини

Два способи вимагають сильного мікробного інокулята для оптимізації результатів. Бактеріальні колонії переважно беруть з кров'яних агарів і агарових дріжджів Sabouraud, за деякими винятками. Инокулят емульгується в рідкому середовищі.

Для бульйону сечовини Стюарт інкубують при 37 ° С протягом 24-48 годин, знаючи, що шукають тільки штами роду Proteus, коли штам є бактерією. Для дріжджів його можна інкубувати при 37 ° C або при кімнатній температурі протягом 24-48 годин інкубації.

У разі бульйону сечовини Christensen інкубують при 37 ° C протягом 24 годин. Якщо тест є негативним, його можна інкубувати до 6 днів. Якщо тест позитивний до 6 годин, це вказує на те, що він є штамом роду Proteus.

У випадку агару Крістенсена сечовина, агаровий скос сильно інокулюють, не проколюючи. Бульйон інкубують і інтерпретують таким же чином.

Контроль якості

Контрольні штами можуть бути використані для тестування середовища, такого як Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae  ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 і Salmonella typhimurium.  Перші два повинні дати позитивні результати і два останні негативні результати.

Список літератури

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Використовують бульйон сечовини Стюарт для тесту уреази, як тест в діагностиці дріжджів. Soc. Мікробіол. 2002; 22 (2): 136-140. Доступно за адресою: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Біохімічні тести для ідентифікації бактерій клінічного значення. 3-е изд. Редакція Panamericana. Буенос-Айрес Аргентина.
3. Forbes B, Sahm D, Вайсфельд А. (2009). Мікробіологічна діагностика Bailey & Scott. 12 ed. Редакція Panamericana S.A. Аргентина.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Мікробіологічна діагностика. 5-е изд. Редакція Panamericana S.A. Аргентина.
5. Лабораторії Британії. Christensen Medio (база агару з сечовиною) 2015. Доступна за адресою: britanialab.com