Характеристики протеїнази K, ферментативна активність і застосування



The протеїнази K являє собою фермент, що належить до групи серинових протеаз, тобто має в своєму активному каталітичному центрі амінокислотний серин і має функцію розриву пептидних зв'язків шляхом гідролізу. У свою чергу цей фермент належить до сімейства білків субтилизинов (пептидаза S8).

Протеїназа K має молекулярну масу (MW) 28,900 дальтон і вперше була виділена в 1974 році з екстрактів гриба. Альбом Engyodontium, раніше відома під назвою Tritirachium альбом Limber.

Він представляє високу протеолітичну здатність, продемонстровану здатністю розкладати кератин, присутній у волоссі. Слово кератин англійською мовою написано "кератин", тому його називали "протеїназою К".

Завдяки високій здатності розщеплювати нативні білки, цей фермент є корисним у різних методах молекулярної біології. В основному він використовується для виділення та приготування нуклеїнових кислот з високою молекулярною масою (МВт).

Протеїназа K діє шляхом вивільнення ядерної ДНК, знищуючи білки і інактивуючи РНКази і ДНКази, тобто виключає нуклеази в препаратах ДНК і РНК..

З іншого боку, було видно, що протеїназа K може гідролізувати деякі денатуровані нативні білки, що викликало інтерес дослідників до його використання при дослідженні прионних білків (PrPC)..

Однак, незважаючи на високу протеолітичну активність, існують білки, стійкі до дії протеїнази К. Серед них є деякі аномальні білки, які називаються прионами (PrPSc), пов'язаними з трансмісивними губкоподібними енцефалопатіями.

Індекс

  • 1 Характеристика протеїнази К
  • 2 Ферментативна активність
  • 3 Програми
  • 4 Переваги протеїнази К
  • 5 Резистентні до протеїназ білки K
  • 6 Посилання

Характеристики протеїнази К

Протеїназа К має третинну структуру, утворену трьома шарами, з β-листом з сімома ланцюгами, що переплітаються між двома шарами спіралей. Оскільки вона належить до сімейства S8 пептидаз, вона характеризується наявністю каталітичної тріади в своєму активному місці, чий послідовний порядок є (Asp, His і Ser), що відрізняє їх від інших сімейств пептидаз..

Цей фермент з групи серинових протеаз характеризується гідролізацією пептидних зв'язків, близьких до карбоксильної групи аліфатичних і ароматичних амінокислот \ t.

З іншого боку, він здатний діяти в присутності деяких корозійних речовин, таких як додецилсульфат натрію (SDS), Tris-HCL і EDTA, які використовуються для сприяння денатурації білків, змушуючи їх втрачати нативну структуру..

Це попередній етап у підготовці білків до техніки електрофорезу. Діапазон рН, при якому діє протеїназа К, досить широкий (від 2,0 до 12,0), з оптимальним рН від 7,5 до 12,0, а його ізоелектрична точка - 8,9. Як можна спостерігати, він є активним проти дуже широкого діапазону рН.

Іншою особливістю, яка виділяється в протеїназі K, є її стабільність при наявності високих температур (50 - 60 ° C).

Ферментативна активність

Протеїназа K потребує присутності іона кальцію, хоча це не впливає на його активність, якщо це необхідно для збереження його стабільності.

Для того, щоб протеїназа K здійснила повне перетравлення субстрату, необхідно наблизити час контакту від 5 хвилин до 2 годин..

Однак у цьому сенсі Daza et al., Порівнювали чистоту ДНК, отриманої в кілька разів піддавання протеїназі K, і прийшли до висновку, що тривала інкубація (до 24 год) значно покращує якість ДНК \ t.

Тепер, по відношенню до концентрації, яка використовується ферменту протеїнази K в різних протоколах, можна сказати, що вона дуже різноманітна.

Його можна використовувати від дуже низьких концентрацій (5 мкг / мл) до концентрацій 500 мкг / мл. Але найчастіше робочі концентрації варіюються в межах 50-100 мкг / мл, особливо для перетравлення білка і інактивації нуклеази. Хоча концентрація 2 мг / мл необхідна для обробки тканин.

Програми

Її застосування дуже широке і може бути узагальнене в наступному:

-Застосовується для розщеплення білків і екстракції ДНК декількома методами, такими як: висалювання, PK-SDS, цетил-триметил-амоній-бромід (CTAB), модифікований ацетат калію і екстракція йодидом натрію..

-Інактивація нуклеаз (РНКази і ДНКази) \ t.

-У техніці гібридизації in situ (HIS), щоб допомогти вивільнити нуклеїнову кислоту, крім усунення небажаних білків.

-Модифікація білка.

-На дослідницькому рівні, в різних дослідженнях.

Переваги протеїнази К

Кілька порівняльних досліджень були проведені серед методів екстракції ДНК з використанням протеїнази К, з іншими, які не використовують її, і всі дійшли висновку, що існують більші переваги при використанні ферменту. Серед переваг можна назвати:

-Отримано високомолекулярну ДНК високої якості і чистоти.

-Витягнута ДНК стабільна до 3 місяців.

Витягнуту ДНК можна використовувати в наступних методах: Саузерн-блот, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), електрофорез, серед інших.

Білки, стійкі до протеїнази K

Різні дослідження прийшли до висновку, що пріони (аномальні PrPSc токсичні білки) диференціюються від білків PrPC (нативні), оскільки вони стійкі до дії протеїнази K, тоді як PrPC чутливі до їх дії.

Інші автори описали, що в структурі PrPSc є чутливі ділянки та інші резистентні до протеїнази K. Однак обидві частини однаково токсичні і інфекційні..

З іншого боку, Bastian і співавтори в 1987 році виділили 4 білка 28, 30, 66 і 76 кДа з виду Spiroplasma mirum. Всі вони були стійкими до дії протеїнази К і також мали поперечну реакцію з деякими прионами.

Відомо, що цей вид може викликати катаракту і важливі неврологічні пошкодження, а завдяки науковим дослідженням Бастіана, серед інших досліджень, була зроблена спроба пов'язати цей мікроорганізм з трансмісивними губкоподібними енцефалопатіями..

Однак етіологія цієї дегенеративної неврологічної патології досі приписується пріонам.

У цьому сенсі Батлер і співавтори в 1991 році ідентифікували і охарактеризували клас стійкого до протеїнази 40 кДа протеїну К з двох штамів Mycoplasma hyorhinis. Цей збудник впливає на свиней, інфікуючи їх тканини, але в цьому випадку не було перехресної реакції з досліджуваними прионами.

Необхідні додаткові дослідження для з'ясування багатьох невідомих про це.

Список літератури

  1. Bastian F, Jennings R та Gardner W. 1987. Антисироватка до скрейпі-пов'язаного білка фібрили перехресно реагує з Spiroplasma mirum білки фібрили. J. Clin. Мікробіол. 25: 2430-2431.
  2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. Оцінка методу вилучення та очищення ДНК з м'язової тканини, фіксованої у формальдегіді від невстановлених трупів.  Журнал Med, 2014; 22 (1): 42-49,
  3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, і Mcgarrity G. Ідентифікація та характеристика протеїназних K-стійких білків у членів класу Mollicutes. Infection and Immunity, 1991, 59 (3): 1037-1042
  4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Порівняння двох протоколів вилучення ДНК з Trypanosoma cruzi вирощені в аксеновой середовищі. Перу. Med. Exp. Public Health  2014; 31 (2): 222-227. Доступно за адресою: scielo.org
  5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E і Palma W. Визначення ефективності п'яти протоколів екстракції ДНК з парафінового матеріалу для молекулярних досліджень. Рев Мед Унів Коста-Ріка. 2007; 1 (1): 10-19.