Поділитися:
Секвенування ДНК Maxam-Gilbert, метод Sanger, приклади
The Секвенування ДНК (дезоксирибонуклеїнова кислота) являє собою процедуру, що виконується в лабораторіях молекулярної біології, що дозволяє дізнатися порядок нуклеотидів в генетичному матеріалі, що представляє інтерес. Крім того, може бути виявлено секвенування РНК (рибонуклеїнової кислоти).
Ця методика була незамінною для розвитку біологічних наук. Він також застосовується до інших галузей знань - наприклад, медичної діагностики та судових розслідувань.
Раніше секвенування нитки ДНК вважалося повільною і дорогою активністю, що дозволило ідентифікувати лише кілька пар основ в олігонуклеотидах.
В даний час, з усіма досягненнями науки, секвенування ДНК є рутинною операцією в багатьох лабораторіях по всьому світу завдяки внеску майже 50 років досліджень у цій галузі. Що стосується довжини ланцюга, то ви можете послідовно прокрутити до мільйонів пар основ.
Для цього розроблені десятки методик, які відрізняються за ціною і точністю. У цій статті ми опишемо як класичні, так і сучасні методики, кожна з яких має свої переваги і недоліки.
До цих пір методики секвенування дозволяють отримати послідовність повних геномів, від малих прокаріотів і дріжджів до геному людини.
Індекс
- 1 Структура ДНК
- 2 Історія
- 3 Метод Сенгера
- 3.1 Основні компоненти реакції
- 3.2 Читання результатів
- 4 Автоматичне секвенування
- 5 Секвенування Максима-Гілберта
- 5.1 Процедура
- 5.2 Читання результатів
- 6 Масивне секвенування
- 6.1 Піросеквенція
- 6.2 Секвенування шляхом синтезу
- 6.3 Секвенування шляхом перев'язки
- 6.4 Послідовність Ion Torrent
- 7 Приклади
- 7.1 Секвенування геному людини
- 8 Важливість та застосування
- 9 Посилання
Структура ДНК
Для розуміння методів і методів, що використовуються для секвенування ДНК, необхідно знати певні ключові аспекти структури і складу молекули.
ДНК - це біомолекула, знайдена у всіх живих істотах, від бактерій до великих водних тварин. Органели, як і мітохондрії і хлоропласти, мають у своєму розпорядженні кругову молекулу ДНК. Навіть у деяких вірусах знайдений генетичний матеріал є ДНК.
Структурно ДНК являє собою набір нуклеотидів. Кожен з них інтегрований вуглеводом, азотистим підставою (А, Т, С або G) і фосфатною групою. Метою секвенування ДНК є виявлення порядку, в якому знаходяться чотири азотисті основи в послідовності.
Історія
У середині 1950-х років дослідники Уотсон і Крік описали структуру ДНК, використовуючи христологічні методи. Однак жоден з цих дослідників не зміг знайти спосіб розкрити послідовність.
Хоча були й попередники, найважливішою подією було створення методу Сангера, в 1977 році. Фредерік Сенгер, батько методу, був британським біохіміком, лауреатом двох Нобелівських премій за його величезний внесок у біологічні науки.
Ця методика також відома в літературі як "припинення ланцюга" або дидезоксинуклеотиди. Далі ми опишемо принципи цієї техніки і ті, які були розроблені на основі вдосконалення та інновацій цього.
Метод Сангера
Розвиток методу Сангера представляв важливу подію в молекулярній біології. Вона включає основні компоненти процесу реплікації ДНК, які зазвичай відбуваються в клітці, але шляхом додавання спеціального компонента: дидезоксинуклеотиди.
Основні компоненти реакції
- ДНК-полімераза: фермент ДНК-полімераза є вирішальним елементом процесу. Ця молекула бере участь у реплікації нитки ДНК, і її роль полягає в синтезі нового ланцюга, що збігається з трифосфатом дезоксирибонуклеотидів з комплементарними..
Пам'ятайте, що в ДНК тиміни (T) спарені з аденинами (A) за допомогою двох водневих зв'язків, а цитозин (C) - з гуаніном (G) трьома мостами.
- Нуклеотиди: секвенування Сенгера включає два типи нуклеотидів: чотири 2'-дезоксинуклеотиди (скорочено dATP, dGTP, dCTP і dTTP) і чотири дидеоксинуклеотиди (ddATP, ddGTP, ddCTP і ddTTP).
Хоча дидезоксинуклеотиди подібні до мономерів, які зазвичай вбудовуються в ДНК, вони не мають групи -OH у своїй структурі. Це робить неможливим додавання до ланцюга нового нуклеотиду.
Тому, коли до спеціального нуклеотиду додається - повністю випадковим чином - до ланцюга у формуванні, синтез паралізується. Таким чином, в кінці реакції є ланцюги різних розмірів, кожна з яких була зупинена в іншій точці.
Експериментально підготовлено чотири випробування. Кожен містить ДНК, виділену з біологічного зразка, що представляє інтерес, нормальні нуклеотиди і один з чотирьох типів спеціальних нуклеотидів. Або спеціальні нуклеотиди відзначені деяким типом флуоресцентного маркера (див. Нижче автоматизоване секвенування).
Читання результатів
Першим етапом є відокремлення кожної з синтезованих ланцюгів відповідно до їх розміру. Деякі з них будуть довшими за інші, залежно від того, де були включені спеціальні бази.
Існують різні біохімічні методики, що дозволяють розділити компоненти суміші, використовуючи розмір як дискримінаційну властивість. У методі Сенгера різні ланцюги відокремлюють за допомогою електрофорезу. У найскладніших варіантах техніки використовується капілярний електрофорез.
Таким чином, більш довгі нитки рухаються менше, ніж коротші варіанти. Потім ця система проходить через зчитувач, який розпізнає маркер, включений в кожен дидезоксинуклеотид. Таким чином, порядок послідовності може бути відомий.
Ця методика "першого покоління" здатна читати фрагменти ДНК не більше 1 кілобази. В даний час метод Сенгера використовується в декількох лабораторіях, як правило, у його сучасних варіантах. Крім того, він використовується для підтвердження результатів, отриманих за допомогою найскладніших методів, але менш точних.
Автоматичне секвенування
Коли великомасштабне секвенування необхідно, процес прискорюється за допомогою автоматизації. Це є варіантом методу закінчення ланцюга Сенгера, де праймери позначені флуоресцентними продуктами для того, щоб розрізнити їх..
Згодом продукт реакції проходить в електрофорезі - все в одній смузі. Коли кожен фрагмент залишає кінцеву частину гелю, його швидко ідентифікують за флуоресцентною міткою з помилкою, що оточує 1%.
Найбільш складні системи мають систему до 96 капілярних труб, керованих комп'ютером, приєднаним до робота. Тобто, 96 зразків ДНК можуть бути оцінені одночасно. Таким чином, процес, що включає електрофорез і аналіз результатів, повністю автоматизований.
За один день ці системи можуть прослідковувати до 550 000 баз. Під час цього процесу людська робота не потрібна, для початку методу потрібно всього 15 хвилин.
Послідовність Максам-Гілбертом
У той самий час, коли Сангер опублікував свою роботу, двоє дослідників на ім'я Аллан Макс і Уолтер Гілберт зуміли розробити інший спосіб отримання послідовності ДНК. Метод набув популярності в той час, але згодом змістився вдосконаленням методу Сенгера.
Всупереч методу Сенгера, секвенування Максана і Гілберта (або хімічне секвенування, як відомо також) не передбачає гібридизаційних реакцій. Методологія полягає в маркуванні реактивних речовин на одному кінці з подальшим процесом очищення.
Одним з негативних аспектів цієї методики є її величезна складність і використання хімічних речовин, які є небезпечними для користувача. Хімічні пробої індукуються застосуванням DMS, мурашиної кислоти, гідразину та гідразину з солями.
Процедура
Протокол починається з маркування на 5'-кінці нитки з фосфорирующим маркером 32, потім відбувається хімічна модифікація азотистої основи і вона відокремлюється. Нарешті відбувається розщеплення абазичного регіону.
Спочатку ланцюжок, який слід секвенувати, скорочується на менші сегменти. Цей етап виконується з рестрикційними ферментами, які призводять до видатних екстремумів.
Далі реакцію проводять з лужної фосфатазой, метою якої є усунення фосфатної групи. Таким чином, полінуклеотидна кіназа може бути використана для виконання мічення.
Ланцюг денатурований (дві нитки відкриті). Потім ми приступаємо до застосування хімікатів. Ці реакції розщеплення здійснюються контрольованим способом, і які типи зв'язків розриваються кожним хімічним речовиною.
Читання результатів
Як і в методі Сенгера, зчитування результатів включає поділ за розмірами ланцюгів, отриманих в системі електрофорезу. Системи, що складаються з поліакриламіду, дозволяють отримати дуже адекватну роздільну здатність для зчитування гелю.
Масивне секвенування
Масивне секвенування охоплює серію нових методів, скорочено NGS, з англійської "Послідовність наступного покоління ".
Методи, каталогізовані як NGS, вимагають попереднього етапу ампліфікації ДНК (вони не працюють з однією молекулою). Крім того, використовувані платформи широко варіюються. Принципи найбільш популярних методів будуть описані нижче:
Піросеквенція
Вона включає моніторинг вивільнення пірофосфату, який відбувається кожного разу, коли до нитки ДНК додають новий нуклеотид. Система ферменту пов'язана, так що випромінювання світла (яке можна виявити камерою) відбувається кожного разу, коли вбудовується новий нуклеотид.
Процес починається з окремої інкубації кожної азотистої основи, щоб перевірити, чи є випромінювання світла. Піросеквенція може виконувати читання довгих ниток, але знайдений рівень помилок високий.
Секвенування шляхом синтезу
Це передбачає включення мічених нуклеотидів. Ці флуоресцентні компоненти додають, промивають і відзначають включений нуклеотид. Потім нуклеотидні мітки усуваються, і синтез ланцюга може продовжуватися. На наступному етапі також буде включено мічений нуклеотид, і згадані етапи будуть повторюватися.
Один недолік цієї методики відбувається, коли флуоресцентні маркери не повністю усуваються. Ці викиди створюють фонові помилки, що призводять до значних помилок.
Послідовність шляхом перев'язки
Ця техніка відрізняється від інших, оскільки вона не використовує ДНК-полімеразу. Замість цього ключовим ферментом для цієї методології є лигаза. Тут використовуються фрагменти ДНК, флуоресцентно мічені, зв'язані ферментом і виявляються.
Найбільшою проблемою цієї методики є дуже коротка довжина фрагмента, здатного обробляти.
Послідовність іонів
Ця методика заснована на вимірі іона Н+ який вивільняється кожного разу при включенні нового нуклеотиду. Принцип досить схожий на піросеквенцію, але набагато дешевше.
Приклади
Секвенування геному людини
Послідовність генома людини була однією з найбільш перспективних проблем в біології, а також була однією з найбільш відомих суперництв в історії науки. Насправді, для вчених, що беруть участь у проекті, секвенування геному стало конкуренцією.
У 1990 році він розпочав те, що називалося «проектом генома людини» на чолі з відомим вченим, лауреатом Нобелівської премії Джеймсом Уотсоном. Через рік, у 1991 році, Вентер бере на себе завдання «побиття» Уотсона і секвенування геному перед ним. Однак у 1992 році Уотсон пішов у відставку, і командував інший дослідник.
У 1995 році Вентер оголосив про свій успіх у повному секвенуванні бактеріального генома методом випадкового секвенування. Подібним чином, протилежна команда оголосила через рік про послідовності геному дріжджів.
У 2000 році гонка була припинена. Обидві компанії опублікували свої попередні результати повного генома в двох найпрестижніших наукових журналах: Природа і Наука.
Однак вчені продовжували працювати над удосконаленням пропозицій, і в 2006 році послідовності були завершені певними хромосомами людини.
Важливість і застосування
Знання порядку нуклеотидів молекули так само важливо, як ДНК, є цінним для біологів і пов'язаних з ними фахівців. Ця ланцюг полінуклеотидів містить всю інформацію, необхідну для розвитку і підтримки всіх форм життя.
З цих причин знання цієї послідовності є необхідним для біологічних досліджень. Принципово, секвенування дозволяє виміряти одне з найважливіших властивостей біологічних систем і встановити відмінності між ними.
Секвенування широко використовують таксономісти і систематики, оскільки певні послідовності ДНК дозволяють встановити критерії, що дозволяють зробити висновок про те, чи належать два організми до одного виду чи ні, а також здатні запропонувати гіпотези про філогенетичні зв'язки між ними..
Крім того, секвенування ДНК має застосування в області медицини і діагностики. Наприклад, існують доступні та доступні системи, які, шляхом секвенування, дозволяють оцінити тенденцію до розвитку певних захворювань (таких як рак), використовуючи так звані прості нуклеотидні поліморфізми (SNP)..
Дослідження криміналістичного та судово-медичного типу також збагачені технікою секвенування і можуть бути використані як достовірні докази участі певної особи у злочині..
Список літератури
- Heather, J. M., & Chain, B. (2016). Послідовність секвенсора: історія секвенування ДНК. Геноміка, 107(1), 1-8.
- Koboldt, D.C., Steinberg, K.M., Larson, D.E., Wilson, R.K., & Mardis, E.R. (2013). Наступне покоління послідовності революції та її вплив на геноміку. Cell, 155(1), 27-38.
- Леві, Дж. (2010). Наукове суперництво. Від проекту Галілея до генома людини. Paraninfo Editorial.
- Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A.R. (1977). Секвенування ДНК з ланцюговими термінаторами. Праці Національної академії наук, 74(12), 5463-5467.
- Шустер С. С. (2007). Секвенування наступного покоління перетворює сьогоднішню біологію. Природа методів, 5(1), 16.
- Xu, J. (ред.). (2014). Послідовність наступного покоління. Caister Academic Press.