Основа випробування, підготовка та використання Voges-Proskauer



The Тест Вогеса-Проскауера є біохімічним тестом, який використовується для ідентифікації бактерій, що належать до сімейства Enterobacteriaceae. Особливо корисно диференціювати штами Escherichia coli з Klebsiella і Enterobacter, серед інших.

Випробування проводять в рідкому культуральному середовищі, який називається метил-червоно-Voges Proskauer, більш відомий під акронімом RM / VP. Це середовище складається з буферного поліпептону, глюкози, фосфату дикалия і дистильованої води.

Поточна середовище RM / VP є модифікацією середовища Кларка і Лубса, яка спочатку містила більш низьку концентрацію пептонів і глюкози. Тому було отримано менше іонів водню, необхідних для позитивної реакції Вогеса-Проскауера.

Випробування базується на здатності мікроорганізму використовувати глюкозу за допомогою шляху бутиленгліколю і утворювати нейтральний кінцевий продукт, який називається ацетоїном, в присутності кисню і лужного рН.

У середовищі RM / VP, крім можливості виявити тест Voges-Proskauer, тест метилового червоного також може бути виявлений.

Індекс

  • 1 Фонд
    • 1.1 Основа тесту Вогеса-Проскауера
    • 1.2 Основи розробки тесту та інтерпретації
  • 2 Підготовка
    • 2.1 Середній RM / VP
    • 2.2 Voges A Reagent
    • 2.3 Реагент Voges B
  • 3 Процедура тесту Вогеса-Проскауера
    • 3.1 Розробка тесту
  • 4 Використовуйте
  • 5 Контроль якості
  • 6 Посилання

Фонд

Основа тесту Вогеса-Проскауера

Присутні в середовищі плюрипептони забезпечують харчові потреби, необхідні для бактеріального росту. Зі свого боку основним з'єднанням є глюкоза. Багато бактерії мають здатність метаболізувати глюкозу і утворювати піровиноградна кислота.

Піровиноградна кислота є середньою точкою в метаболізмі глюкози і звідти кожен мікроорганізм може приймати різні шляхи. Деякі з них будуть утворювати змішані кислоти, такі як молочна кислота, оцтова кислота, мурашина кислота і бурштинова кислота, а інші будуть утворювати нейтральні продукти, такі як 2,3-бутандіол..

Тест Voges-Proskauer виявляє здатність мікроорганізму утворювати ацетилметилкарбінол (ацетоїн), проміжний продукт 2,3-бутандіолу в аеробних умовах.

Ацетоїн знижується і утворює 2,3-бутандіол, але ця реакція є оборотною, тому якщо 2,3-бутандіол окислюється, утворюється ацетоїн. Тому кисень є істотним.

Фосфат дикалії є буфером, який гасить суміш при рН 6,9 ± 0,2..

Основа для розробки тесту та інтерпретації

Для демонстрації реакції необхідно проводити розробку з використанням двох реагентів (реагентів Barrit), відомих як Voges A і Voges B.

Voges A - 5% розчин α-нафтола, Voges B - препарат гідроксиду калію 40%. Якщо гідроксид калію відсутній, його можна замінити на 40% гідроксид натрію.

А-нафтол є каталізатором, який збільшує інтенсивність кольору реакції, що робить тест більш чутливим. По-перше, завжди слід додавати α-нафтол, перемішуючи пробірку таким чином, щоб середовище контактувало з киснем. Таким чином, присутній ацетоїн окислюється до діацетилу, а 2,3-бутандіол окислюється з утворенням ацетоїну, переводячи його в діацетил..

Таким чином, α-нафтол зв'язується з діацетилом, який, у свою чергу, пов'язаний з ядром гуанідину, присутнього в амінокислоті аргінін, причому останній надходить з плюрипептона..

Зі свого боку, калій або гідроксид натрію відповідає за поглинання СО2 і реагують з пептонами. Ця реакція призводить до утворення рожево-лососевого кольору, що добре видно після струшування трубки.

Для того, щоб миттєво відбувалося забарвлення, необхідно змішати правильні кількості діацетилу, пептона та α-нафтола. Якщо цього не відбувається, дайте трубці залишитись на 15 хвилин перед інтерпретацією.

Зазвичай тест позитивний після 2 - 5 хвилин, коли спостерігається слабке рожеве забарвлення. Якщо залишити в спокої протягом 30 хв до 1 години, інтенсивність кольору буде максимальною (темно-червона).

Негативний тест буде очевидним, коли бульйон жовтий. Через 1 годину, якщо випробування є негативним, колір міді може утворитися в результаті реакції гідроксиду калію на α-нафтол \ t.

Підготовка

Середній RM / VP

Зважують 17 г зневодненого культурального середовища і розчиняють в одному літрі дистильованої води. Дайте витримати 5 хвилин. Нагріти до кипіння до повного розчинення. Подавати 3 - 4 мл у пробірки і стерилізувати в автоклаві при 121 ° С протягом 15 хвилин.

Зневоднене культуральне середовище є бежевим, а підготовлену середу - світло-янтарною.

Кінцевий рН середовища становить 6,9 ± 0,2.

Водний реагент

Зважують 5 г α-нафтола і розчиняють в 50 мл етилового спирту (абсолютний). Згодом продовжують додавати етиловий спирт до 100 мл.

Реагент Voges B

Зважують 40 г гідроксиду калію і розчиняють у 50 мл дистильованої води в хімічному стакані. Скло слід поміщати в холодну водяну баню для контролю температури, тому що під час розчинення препарат різко підвищується.

Після охолодження розчину його переносять на градуйований балон і доводять до 100 мл дистильованою водою.

Процедура тесту Вогеса-Проскауера

Для проведення тесту Voges-Proskauer, бульйон RM / VP інокулюють досліджуваним мікроорганізмом, з чистої культури від 18 до 24 год..

Інокулят не повинен бути занадто щільним. Його інкубують при 35-37 ° С протягом 24-48 годин, хоча іноді інкубація необхідна протягом декількох днів. Cowan і Steel вважають, що 5 днів є мінімальним часом інкубації, необхідним для виявлення всіх позитивних видів Voges-Proskauer (VP) сімейства Enterobacteriaceae.

Розробка тесту

Розділіть 1 мл аликвоту в пробірці і виконайте наступне: помістіть 12 крапель (0,6 мл) реагенту Voges A і 4 краплі (0,2 мл) Voges B. протягом 5 - 10 хвилин перед виконанням. Проте, якщо тест все ще залишається негативним, дайте йому стояти і спостерігайте пробірку через 30 хвилин до 1 години.

Поява рожево-червоного кольору вказує на позитивну реакцію Вогеса-Проскауера. Якщо середовище залишається жовтим, реакція негативна.

Додавання розробників у зазначеному порядку та кількості є важливим для уникнення помилкових негативів.

Використовуйте

Тест Voges-Proskauer корисний для диференціювання штамів E. coli які є VP-негативними, з родів Klebsiella, Enterobacter, Serratia, серед інших, які є позитивними.

Контроль якості

Контрольні штами можуть бути використані для перевірки якості приготованого середовища. Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium і Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Очікувані результати є позитивними реакціями Вогес-Проскауера тільки на K. pneumoniae і E. cloacae. Решта дають негативні реакції.

Список літератури

  1. Лабораторії Британії. MR-VP Medium. 2015. Доступно за адресою: www.britanialab.com
  2. Microkit Laboratories M-Ident Voges Proskauer. 2014. Доступно: http://www.medioscultivo.com
  3. Mac Faddin J. (2003). Біохімічні тести для ідентифікації бактерій клінічного значення. 3-е изд. Редакція Panamericana. Буенос-Айрес Аргентина.
  4. Forbes B, Sahm D, Вайсфельд А. (2009). Мікробіологічна діагностика Bailey & Scott. 12 ed. Редакція Panamericana S.A. Аргентина.
  5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Мікробіологічна діагностика. 5-е изд. Редакція Panamericana S.A. Аргентина.