Фундамент, підготовка та використання Agar Müeller Hinton

The Агар Мюллера Це тверда, неселективна живильне середовище, що складається з м'ясної інфузії, пептона казеїнової кислоти, крохмалю, агару і дистильованої води. Ця середовище дозволяє відмінно розвиватися мікробним шляхом у найбільш швидкорослих бактерій.

Спочатку його створили Джон Говард Мюллер і Джейн Хінтон, щоб ізолювати бактеріальні потреби, такі як Neisseria gonorrhoeae і Neisseria meningitidis. Однак, завдяки своїм характеристикам він виявився ідеальним для вивчення сприйнятливості до антибіотиків, забезпечення надійних і відтворюваних результатів..

З цієї причини агар Мюллера є культуральним середовищем, прийнятим Інститутом клінічних і лабораторних стандартів (CLSI) і Європейським комітетом з тестування антимікробної сприйнятливості для виконання тесту антимікробної сприйнятливості методом дифузії диска Кірбі. Бауер.

Індекс

• 1 Фонд
• 2 Підготовка
• 3 Використання
  • 3.1 Антимікробна техніка
  • 3.2 Стратегічне розміщення дисків на агарі Müeller Hinton
• 4 Причини помилкових результатів
• 5 Обмеження
• 6 Контроль якості
• 7 Посилання

Фонд

Оскільки він є неселективним живильним середовищем, він відмінно підходить для росту більшості патогенних бактерій.

З іншого боку, його простий склад робить речовини легко дифундувати на ній, що є істотною характеристикою тесту сприйнятливості методом дискової дифузії..

Іншою його характеристикою є те, що він містить низьку кількість інгібіторів, що дозволяє ефективно оцінювати сульфонаміди, триметоприм і тетрациклін..

Однак слід мати на увазі, що середовище повинно відповідати певним умовам для забезпечення його належного функціонування, включаючи:

Регулювання РН, глибина агару і адекватна концентрація тиміну, тимидина, Са⁺⁺, Mg⁺⁺ і Zn⁺⁺.

Ми також повинні знати, що методологія є стандартизованою і тому всі параметри повинні бути виконані, такі як:

Концентрація інокулята, концентрація і збереження антибіотичних дисків, розміщення відповідного числа дисків на агарі, відстань між одним диском і іншим, стратегічне розміщення певних антибіотиків, атмосфера, температура і час інкубація.

Підготовка

Зважують 37 г зневодненої середовища Мюллера Хінтона і розчиняють у 1 л дистильованої води. Нагрійте середовище при перемішуванні, щоб розчинити його. Дайте кип'ятити 1 хвилину.

Візьміть автоклав для стерилізації при 121 ° C протягом 15 хвилин. При видаленні з автоклава фіолу слід помістити на водяну баню при температурі 50 ° C для охолодження. Налийте 25 до 30 мл у стерильні чашки Петрі діаметром 10 см. \ T.

Пластини повинні мати середню товщину 4 мм (ідеальну), з допустимим діапазоном 3-5 мм.

Якщо бажано приготувати кров'яний агар з використанням агарової основи Müeller Hinton, перед подачею на пластини доливають 5% стерильної та дефібринованої крові баранини..

Кінцевий рН середовища має бути між 7,2-7,4.

Інвестуйте і зберігайте в холодильнику, до використання. Перед використанням вийміть пластину до кімнатної температури.

Колір підготовленого середовища - світло-бежевий.

Використання

Його використовують для проведення антибіограми або антибіотикочутливості для більшості не швидкозростаючих патогенів.

Якщо агар доповнюється кров'ю, він служить для виконання антибіограмми вимогливих мікроорганізмів, таких як: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, серед інших. Він також використовується для ізоляції Legionella pneumophila.

Техніка антибіограми

Перед проведенням антибіограми необхідно приготувати бактеріальний розчин, еквівалентний 1,5 × 10⁸ клітини.

Для цього від чистої культури відбирають від 3 до 4 колоній і суспендують у триптазовому соєвому бульйоні або в бульйоні Мюллера Хінтона, інкубують протягом 2 - 6 годин і концентрують стерильним сольовим розчином, порівнюючи з стандартом Mac Farland. 0,5%.

Якщо вони потребують мікроорганізмів, колонії можуть бути суспендовані безпосередньо, поки вони не досягають концентрації 0,5% Mac Farland. Згодом пластину Мюллера Хінтона висівають тампоном, просоченим приготованим бактеріальним розчином.

Для цього занурте тампон у розчин, а потім видаліть надлишок рідини, натиснувши на стінки трубки. Відразу після того, як тампон пропущений по всій поверхні, не залишаючи незайманих ділянок, то злегка повертайте пластину і повторно посійте. Операцію повторюють ще 2 рази.

Дайте витримати 10 хвилин, а потім помістіть антибіотичні диски стерильними щипцями, залишивши між ними простір на 24 мм. Після розміщення кожного диска на агарі притискайте кожен з них затискачем, щоб переконатися, що вони добре приклеєні.

Після закінчення процесу пластину інвертують і інкубують при 35-37 ° С в аеробіозі протягом 16-18 годин. Якщо це вимогливий мікроорганізм, він може вимагати мікроаерофілії, а якщо антибіограма містить диски оксациліну, її слід читати через 24 години..

Для вимірювання діаметра кожного ореолу використовується лінійка. Результати повинні бути записані в мм. Згодом отримані значення співвідносяться з таблицями точок розрізу, опублікованими в поточному посібнику CLSI.

Повідомляють як чутливий (S), проміжний (I), або резистентний (R), як може бути.

Антибіотики підбираються відповідно до ізольованого мікроорганізму і типу інфекції, що відбувається.

Іноді слід враховувати стратегічне розміщення антибіотиків, щоб показати фенотипічні структури резистентності.

Стратегічне розміщення дисків на агарі Müeller Hinton

Для ентеробактерій диск клавуланової кислоти повинен бути розміщений перед цефалоспоринами 3-го і 4-го покоління. Розширення яйцеподібної форми вказує на те, що штам є продуцентом бета-лактамаз з розширеним спектром (ESBL). Це означає, що пацієнта не слід лікувати будь-яким цефалоспорином.

У стафілококу важливо розмістити еритроміцин або диск азитроміцину перед диском кліндаміцину (D-test)..

Резистентний гало в еритроміцині і сплющення в галозі кліндаміцину вказує на те, що штам має індуковану стійкість до кліндаміцину, штаму (RIC). Це означає, що лікування кліндаміцином не буде ефективним.

Для пошуку індукованих штамів AMP C в Enterobacteriaceae і деяких неферментирующих Грам негативних бацил, диски цефтазидиму, цефокситина або піперациліну тазобактану стикаються з диском іміпенем на відстані 27 мм.

Гало, сплющений в одному з дисків, що стоять перед іміпенем, вказує на наявність індукованого AMP C.

Для пошуку конститутивного АМФ С, диск 500 мкг клоксациліну стикається з цефтазидимом (30 мкг) і цефотаксимом (30 мкг) на відстані 25 мм. Розширений гало в одному з цефалоспоринів вказує на позитивність.

Диск клоксациліну можна також замінити на 9 мм диск фільтруючого паперу Whatman № 6, просоченого фенилбороновой кислотою (400 мкг) з відстанню 18 мм. Вона інтерпретується так само, як і попередня.

Нарешті, дослідити виробництво металло-бета-лактамаз, особливо в Росії Pseudomonas aeruginosa, на відстані 15 мм використовують диск, просочений 10 мкл етилендіамінтетраоцтової кислоти (EDTA 750 мкг) і тиогликолевую кислоту (SMA 300 мкг)..

Тест є позитивним, якщо спостерігається розширення ореолів іміпенему або меропенему по відношенню до диска EDTA / SMA. Цей результат повинен бути підтверджений модифікованим тестом Ходжа.

Цей спосіб полягає в інокуляції штаму Escherichia coli ATCC 25922 на плиті Мюллера Хінтона. Іміпенем диск розміщується в центрі пластини, а потім виконується канавка від диска до периферії з деформацією P. aeruginosa підозрюваний Ви можете перевірити до 4 штамів на пластину.

Тест буде позитивним, якщо існує зона спотворення галогену іміпенема навколо смуги.

Причини помилкових результатів

-Диски погано збережених антибіотиків можуть виробляти помилкові опори. Наприклад, оксаціліновий диск дуже вразливий до температурних змін.

-Значення рН середовища нижче зазначеного (кислота) утворює менші ореоли в аміноглікозидах і макролідах (ризик хибної резистентності), а великі ореоли в пеніциліні, тетрацикліні та новобіоціні (ризик помилкової чутливості).

-Якщо рН вище зазначеного (лужного), описані вище ефекти є зворотними.

-Носії з високими концентраціями тиміну і тимидина впливають значною мірою на зниження галопів гальмування сульфонамідів і триметоприму.

-Високі концентрації кальцію і магнію призводять до помилкової резистентності аміноглікозидів, поліміксину В і тетрациклінів проти штамів Pseudomonas aeruginosa.

-Низькі концентрації кальцію і магнію призводять до помилкової чутливості аміноглікозидів, поліміксину В і тетрациклінів проти штамів Pseudomonas aeruginosa.

-Наявність цинку впливає на результати дисків карбапенемів (іміпенем, меропенем і ертапенем)..

-Товщина середовища нижче 3 мм дає помилкові результати чутливості, тоді як товщина вище 5 призведе до помилкового опору.

-Мобілізація дисків у антибіограмі дасть деформовані ореоли, оскільки виділення антибіотиків є негайним.

- Дуже слабкі інокуляти впливають на результати, оскільки не буде однорідного або конфлюентного росту в агарі, необхідною умовою для вимірювання зон гальмування, на додаток до того, що ореоли можуть дати більше, ніж звичайно.

-Перевантажений інокулят може дати ореоли менше, ніж звичайно.

-Недотримання відстані між дисками призводить до перекриття одного ореолу іншим, і його неможливо прочитати правильно.

-Інкубуйте з CO₂ збільшує розміри ореолів тетрациклінових і метицилінових дисків.

-Інкубація при температурі нижче 35 ° С дає великі гало.

-Додавання крові зменшує розмір ореолу сульфаніламідів.

Обмеження

Чутливість антибіотика, продемонстрована в антибіограмі проти мікроорганізму (in vitro) не є гарантією того, що він працюватиме in vivo.

Контроль якості

Щоб дізнатися, чи містить середовище потрібну кількість тиміну, слід висівати штам Enterococcus faecalis ATCC 29212 і перевіряти сприйнятливість до триметоприму сульфаметоксазолу (SXT), він повинен давати ореолу рівне або> 20 мм, щоб бути задовільним.

Список літератури

1. "Агар Мюллер-Хінтон". Вікіпедія, Вільна енциклопедія. 16 листопада 2018, 12:23 UTC. 27 січ., 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Вайсфельд А. (2009). Мікробіологічна діагностика Bailey & Scott. 12 ed. Редакція Panamericana S.A. Аргентина.
3. Cona E. Умови для хорошого дослідження сприйнятливості методом агарного дифузійного тесту. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Лабораторія Difco Francisco Soria Melguizo. Агар Мюллера з 5% овечої крові. 2009. Доступний за адресою: http://f-soria.es
5. Лабораторія агару BD Müeller Hinton II. 2017. Доступно за адресою: .bd.com
6. Лабораторії Британії. Агар Мюллера. 2015. Доступно за адресою: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Мікробіологічна діагностика. 5-е изд. Редакція Panamericana S.A. Аргентина.
8. Martínez-Rojas D. Беталактамаса типу AmpC: загальні та методи для фенотипового виявлення. Soc. Мікробіол. 2009; 29 (2): 78-83. Доступно за адресою: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Фенотипічне виявлення металлобеталактамаз у клінічних ізолятах Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Доступно за адресою: scielo.org.