Фундамент, матеріали, техніка та використання грамотного граму



The Грам пляма є найпростішим і найбільш корисним методом фарбування в діагностичній мікробіології. Ця техніка була створена датським доктором Хансом Крістіаном Грамом в 1884 році, якому вдалося класифікувати бактерії в грампозитивних і грамотрицательных за складом клітинної стінки..

Техніка зазнала певних модифікацій Хакера в 1921 році для стабілізації реагентів і поліпшення якості плями, так що пляма Грам також відома як Грам-Хакер.

За допомогою цієї методики також можна спостерігати форму, яку мають мікроорганізми, тобто чи є вони коками, бацилами, коккобацилами, плеоморфними, ниткоподібними, серед інших. Як і його розподіл у просторі: у кластері, у ланцюзі, ізольовано, парами, у тетрадах тощо..

Коли підозрюється бактеріальна інфекція, більшість отриманих зразків слід розкладати на предметне скло і фарбувати Грам для обстеження під мікроскопом..

Звіт Грама буде вести лікаря про те, який тип мікроорганізму може бути причиною інфекції, до отримання кінцевого результату врожаю.

У деяких випадках життя пацієнта дуже скомпрометована, тому лікарі терміново потребують доповіді Грама для проведення емпіричного лікування, в очікуванні ідентифікації мікроорганізму..

Наприклад, якщо грам показує, що в спинномозковій рідині є грампозитивні коки, лікар буде орієнтувати початкову терапію антибіотиками, які усувають цей тип бактерій, згідно з протоколами, встановленими для нього..

Після отримання кінцевого результату з назвою ізольованого мікроорганізму та його відповідного антибіограма, лікар оцінить, чи потрібно змінювати терапію. Це рішення буде прийняте відповідно до дослідження сприйнятливості мікроорганізму до антибіотиків, які він отримує, та еволюції пацієнта.

Індекс

  • 1 Фонд
  • 2 Матеріали
  • 3 Підготовка барвників та реагентів
    • 3.1 Розчин кристалічного фіолетового
    • 3.2 Йодо-Лугол
    • 3.3 Відбілювання
    • 3.4 Контраст
  • 4 Зберігання реагентів
  • 5 Підготовка розповсюдження зразка для фарбування
    • 5.1-грам прямих зразків
    • 5,2 -Грам культур
  • 6 Техніка
  • 7 Утиліта
  • 8 Поширені помилки
  • 9 Посилання

Фонд

Це техніка, яка представляє 4 фундаментальні кроки: фарбування, фіксація з морилкою, знебарвлення і контратактивність. Тому ця методика крім фарбування бактерій також диференціює їх.

Першим використовуваним барвником є ​​кристал фіолетовий. Вона має спорідненість до пептидоглікану і фіолетового кольору, щоб пофарбувати всі присутні бактерії, тоді розміщується лугол, який діє як протрава, тобто він буде викликати утворення нерозчинних комплексів кристалічного фіолетово-йод - рибонуклеарних білків всередині клітини.

Грампозитивні бактерії, що мають товсту стінку пептидоглікану, утворюють більше комплексів (кристалічний фіолетовий-йод), тому вони зберігають барвник.

Це також впливає на те, що стіна грампозитивних бактерій містить більшу кількість ненасичених кислот, які демонструють високу спорідненість до окислювачів (Lugol)..

Між тим, грамнегативні бактерії мають тонкий шар пептидоглікану, що робить бактерії менш складними, ніж грампозитивні бактерії..

Потім наступає крок зміни кольору, де грампозитивні і грамнегативні бактерії ведуть себе по-різному.

Грам-негативні бактерії містять зовнішню мембрану, багату ліпополісахаридами, яка є частиною її клітинної стінки. Жири руйнуються при контакті з спиртовим ацетоном, тому зовнішня мембрана дестабілізується, випускається фіолетовий кристал.

Саме таким чином він пофарбований сафранином або основним фуксином, приймаючи червоний колір.

У випадку грампозитивних бактерій, вони витримують знебарвлення, оскільки відбілювач вимикає пори, що перешкоджає виходу кристалічного фіолетового / йодного комплексу.

Тому забарвлення фіолетовим кристалом є стабільним, і немає місця для сафранину або фуксину. Через це ці бактерії забарвлюються сильно або пурпурно.

Матеріали

Набір кольорів Gram складається з:

  • Фіолетовий кристал
  • Лугол
  • Ацетон спирт
  • Сафранин або основний фуксин

Приготування барвників і реагентів

Розчин кристалічного фіолетового

Рішення A:

Фіолетовий кристал -2 гр

Етиловий спирт 95% -20cc

Рішення B:

Оксалат амонію -0,8 гр

Дистильована вода-80 см3

Для остаточного приготування фіолетового кристала розчин 1:10 розбавляють дистильованою водою і змішують з 4 частинами розчину В. Суміш зберігають протягом 24 годин перед використанням. Його фільтрують в колбі для фарбування бурштину за допомогою паперового фільтра.

Сума, яка буде використовуватися щодня, переноситься в бурштинову пляшку з крапельницею.

Йодо-Луголь

Зважують і вимірюють вказану кількість кожного з'єднання наступним чином:

Кристали йодо - 1гр

Калій йодид - 2гр

Дистильована вода -300 см3

Йодид калію розчиняється потроху у воді, а потім додається йод. Розчин голиться до пляшки бурштинового кольору.

Сума, яка буде використовуватися щодня, переноситься в меншу бурштинову пляшку з крапельницею.

Відбілювання

95% етиловий спирт -50 мл

Ацетон - 50 мл

Він готується в рівних частинах. Накрийте добре, вона прагне випаруватися.

Місце в пляшці з крапельницею.

Цей препарат забезпечує знебарвлення у помірному часі 5-10 сек і є найбільш рекомендованим.

Початківці вважають за краще використовувати тільки 95% етиловий спирт, де зміна кольору відбувається повільніше від 10 до 30 сек.

У той час як найбільш досвідчені можуть використовувати чистий ацетон, де знебарвлення відбувається дуже швидко від 1 до 5 сек.

Контраст

Основний розчин сафренану

Сафранина -2,5 гр

Етиловий спирт 95% -100 см3

Після зважування зазначена кількість сафранину розчиняється в 100 см 3 етилового спирту до 95%.

Робочий розчин сафранину готують з основного розчину.

Для цього необхідно виміряти 10 см 3 вихідного розчину, додати 90 мл дистильованої води для завершення 100 мл.

Рекомендується перенести суму, яка буде використовуватися щодня, на бурштинову пляшку з крапельницею.

Мікроорганізми, які слабо забарвлюються за Грамом з Грам-Хакером, такі як певні анаероби, Legionella sp, Campylobacter sp і Brucella sp, вони можуть бути набагато краще зафарбовані, якщо використовується модифікація, зроблена Kopeloff до Gram-Hucker фарбування, називається Gram-Kopeloff пляма, використовується.

Ця методика змінює барвник сафранину на основний фуксин. З цією модифікацією можна ефективно забарвлювати вищезгадані мікроорганізми.

Зберігання реагентів

Готові барвники слід зберігати при кімнатній температурі.

Приготування зразка поширюється на колір

Зразок повинен містити не менше 105 мікроорганізми перед спостереженням мікроорганізму в мазку, ймовірно. Спреди можуть бути виготовлені з прямого зразка або культур у твердих або рідких середовищах.

Спреди повинні бути однорідними, добре розподіленими і не занадто товстими для кращої візуалізації наявних структур.

-Грам прямих зразків

Сеча грам без центрифуги

Сечу змішують і 10 мкл поміщають на предметне скло. Спостереження щонайменше одного поля бактерії / занурення вказує на наявність інфекції.

Це означає, що культура буде мати приблизно більше 100000 КУО / мл (105 CFU / мл) сечі в 85% випадків.

Цей спосіб не є корисним для підрахунку колоній нижче 100000 ДЕЩО.

LCR Gram

CSF слід центрифугувати, супернатант видаляють і гранул розкладають на предметне скло. Ця рідина є стерильною в нормальних умовах; спостереження бактерій вказує на інфекцію.

Грам респіраторних зразків

Грам мокротиння, бронхіальний або бронхоальвеолярний лаваж, хоча можуть існувати різноманітні мікроорганізми, завжди буде керуватися діагнозом, крім того, що корисний тип спостережуваних клітин.

У випадку мокротиння мазок слід готувати з найбільш гнійними порціями зразка.

Табурет Грам

Не рекомендується виконувати грам для цього типу зразків, оскільки він не має діагностичного значення.

-Грамотні культури

Їх можна здійснювати двома способами: один - з рідких культур, другий - з твердих культур.

Рідкі культури

З рідких культур надзвичайно просто; під світлішею береться кілька смажених каламутних відварів, які розміщуються на чистому і сухому слайді, даючи кругові рухи від центру до периферії, щоб рівномірно розподілити матеріал.

Дозволяється спонтанно висушуватися на повітрі. Після висихання матеріал закріплюється на аркуші теплом. Для цього, за допомогою затискача, лист 3 пропускають 4 рази через полум'я пальника Бунзена, стежачи за тим, щоб не спалювати матеріал.

Листу дають охолонути і поміщають на фарбувальний міст.

Тверді культури

Щоб виконати розширення для плями Gram з твердої культури, виконайте наступні дії:

Перед вибором колоній, які необхідно взяти, слайд повинен бути підготовлений, помістивши дві краплі приблизно зі стерильного фізіологічного сольового розчину.

Якщо оригінальна культуральна пластина містить декілька різних типів колоній, виділена колонія кожного з них буде обрана для виконання граму. Кожна колонія буде взята з платинової петлею, щоб розчинити її в розчині, який раніше був поміщений на предметне скло.

Кругові рухи даються від центру до периферії, щоб розподілити колонію однорідно на слайді..

Дозволяється спонтанно висушуватися на повітрі. Після висихання аркуш фіксується теплом, як описано вище (розпалюється ковзанка із запальничкою), обережно не спалюючи матеріал.

Ця процедура повинна виконуватися з кожним різним типом колонії. На аркуші паперу слід зазначити порядок спостереження, наприклад:

Колонія 1: Жовта бета-гемолітична колонія: грампозитивні коки спостерігалися в кластерах

Колонія 2: Крем-колонія, без гемолізу: спостерігалися грамнегативні коккобацили.

Кожен аркуш повинен бути позначений, щоб знати, що ми спостерігаємо.

Техніка

Метод фарбування по граму надзвичайно простий у виконанні і відносно недорогий і не може бути пропущений в лабораторії мікробіології.

Те ж саме робиться так:

  1. Зафіксуйте мазок теплом і поставте на кольоровий міст.
  2. Лист повністю накритий фіолетовим склом протягом 1 хвилини.
  3. Промити водою. Не сушіть
  4. Накривають пластину розчином Люголя, залишають на 1 хвилину. Промити водою. Не сушіть.
  5. Змішують протягом 5-10 секунд з легким перемішуванням в ацетоновому спирті. Або розмістіть аркуш у вертикальному положенні і нанесіть на поверхню крапельки знебарвлюючого агента, доки залишиться фіолетове скло. Не перевищуйте.
  6. Промити водою. Не сушіть.
  7. Замініть лист на кольоровий міст і накрийте на 30 сек сафранином (Gram-Hucker) або 1 хв з основним фуксином (Gram-Kopeloff).
  8. Промити водою
  9. Дайте висихати спонтанно у вертикальному повітрі.

Після висихання помістіть 1 краплю зануреної олії, щоб спостерігати її під об'єктивом 100X в оптичному мікроскопі.

Утиліта

Ця методика дозволяє відрізнити морфотипові відмінності більшості бактерій.

Цим кольором відрізняються також дріжджі. Вони беруть кристал фіолетовий, тобто вони забарвлюють грам позитивним.

З іншого боку, можна виділити грампозитивні спороутворюючі бацили, в яких у бацилі спостерігається прозорий простір, де формується ендоспора, хоча спори не добре забарвлюються. Для використання спор використовуються інші методи, такі як Шеффер-Фултон.

Слід зазначити, що це пляма не служить для забарвлення всіх типів бактерій, тобто є випадки, коли фарбування не працює.

У цьому випадку можна згадати бактерії, які не мають клітинної стінки. Наприклад: рід Mycoplasma, сферопласти, Ureaplasma, L-форми і протопласти.

Вона також забруднює бактерії стінами, багатими міколовими кислотами, такими як мікобактерії та внутрішньоклітинні бактерії, такі як Chlamydias і Rickettsias.

Також неефективно забарвлювати більшість спірохетальних бактерій.

Є бактерії одного і того ж роду, які можна спостерігати в тому ж самому зразку, що і грампозитивні і як грамнегативні. Коли це відбувається, його називають змінним забарвленням за Грамом, що може бути викликане зміною поживних речовин, температури, pH або концентрації електролітів..

Поширені помилки

Вибілювати надмірно

Перебільшення на етапі знебарвлення може викликати спостереження за помилковими грамнегативними мікроорганізмами.

Не дочекайтеся достатнього часу висихання, щоб додати масло для занурення:

Ця помилка викликає утворення жирних міцел, що ускладнює спостереження за наявними структурами. Це відбувається, коли нафта приєднується до молекул води, наявних у мазку.

Змінити порядок реагентів:

Така помилка призведе до того, що грамнегативні бактерії показують фіолетовий колір, тобто помилковий Gram-позитивний.

Використовувати старі культури (тверді або рідкі):

Це може призвести до того, що грампозитивні бактерії забарвлюють грамнегативні (помилковий грам негатив). Це відбувається тому, що в старих культурах, ймовірно, є мертві або пошкоджені бактерії, і в цих умовах бактерії не зберігають фіолетовий кристал..

Використовуйте дуже старий розчин Lugol:

З плином часу lugol втрачає свої властивості і колір його зникає. Якщо використовується вже вироджений реагент, він не фіксує кришталево-фіолетовий колодязь, тому є можливість отримання візуалізації мікроорганізмів хибно грамнегативних.

Блакитний фон

Належним чином знебарвлений фон буде червоним. Синій фон свідчить про недостатню зміну кольору.

Список літератури

  1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Шерріс. Мікробіологія Medical, 6-е видання McGraw-Hill, Нью-Йорк, США
  2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Мікробіологічна діагностика. (5-е изд.). Аргентина, редакція Panamericana S.A..
  3. Forbes B, Sahm D, Вайсфельд А. 2009. Мікробіологічна діагностика Bailey & Scott. 12 ed. Аргентина Panamericana S.A Редакція
  4. Casas-Rincón G. 1994. Загальна мікологія. 2-е місце, Центральний університет Венесуели, видання бібліотеки. Венесуела, Каракас.
  5. "Пляма грам" Вікіпедія, Вільна енциклопедія. 4 жовтня 2018, 23:40 UTC. 9 грудня 2018, 17:11. Взяті з es.wikipedia.org.
  6. González M, González N. 2011. Керівництво з медичної мікробіології. 2-е видання, Венесуела: Дирекція ЗМІ та публікацій Університету Карабобо.
  7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Базове фарбування в лабораторії мікробіології. Дослідження інвалідності. 2014; 3 (1): 10-18.