Основа, матеріали, техніка і використання плями Райта



The Пляма Wrigth це фарбувальна техніка, створена американським патологоанатомом Джеймсом Гомером Райт в 1902 році, з плями Романовського. Як пляма Романовського було нестійким, Wrigth включав метанол як розчинник і фіксатор.

Це забарвлення є поліхроматичним, що означає, що він генерує кілька кольорів залежно від структури, яку поглинає барвник. Ця технологія фарбування широко використовується для виконання диференційованих лічильників лейкоцитів і вивчення морфології еритроцитів, тромбоцитів і лейкоцитів периферичної крові та кісткового мозку..

Його застосування є дуже важливим, оскільки аномалії можуть спостерігатися в різних клітинних лініях крові, полегшуючи діагностику таких захворювань, як лейкемія або бактеріальні або паразитарні інфекції..

Можливо, це найпоширеніші програми, в яких використовується ця техніка, однак вони не єдині. Він також корисний у пробах, відмінних від крові та кісткового мозку, таких як зразки носового виділення, фекального слизу, мокротиння, шкіри та інших..

Індекс

  • 1 Основа плями Райта
  • 2 Матеріали
    • 2.1 Підготовка
    • 2.2 Буферний буферний розчин
    • 2.3 Додаткові матеріали, необхідні для виконання фарбування
  • 3 Компоненти плями Райта
    • 3.1 Метанол
    • 3.2 Амортизатор
    • 3.3 Eosin (Y)
    • 3.4 Метиленовий синій
  • 4 Техніка
  • 5 Утиліта
    • 5.1 Гематологія
    • 5.2 Секреція носа
    • 5.3 Паразитологія
    • 5.4 Респіраторні інфекції
    • 5.5 Бактеріологія
    • 5.6 Мікологія
  • 6 Як спостерігаються структури зразка крові з плямою Райта??
  • 7 Рекомендації для хорошого фарбування
  • 8 Поширені помилки в кольорі Wrigth
    • 8.1 Дуже блідий фарбування
    • 8.2 Осад барвника
    • 8.3 Мазок з надзвичайно червоною або блакитною забарвленням
  • 9 Режим зберігання
  • 10 Посилання

Основа плями Райта

Пляма Райта народилося від плями Романовського, який складається з розчину метилового спирту з кислотного барвника (еозину Y) і основного (метиленового синього) та його продуктів окислення..

Суміш барвників, що використовуються в плямі Райта, викликає ефект, відомий як Романовський, тобто забезпечує гарне фіолетове забарвлення ядрам лейкоцитів і нейтрофільним гранулам, в той час як еритроцити пофарбовані в рожевий колір..

Компоненти, відповідальні за надання колірного діапазону, типового для плями Райта, - це синій B і еозин Y. Спостережуваний ефект буде залежати від зв'язування барвників з хімічними структурами і взаємодій синього B і еозину Y.

Кислі структури, такі як нуклеїнові кислоти, ядерні білки і реактивна незріла цитоплазма деяких типів клітин, фіксують синій B (основний барвник).

Хоча основні структури, такі як гемоглобін, гранули сегментованих еозинофілів, серед інших клітинних структур, фіксують еозин Y (кислотний барвник).

На результат фарбування можуть впливати різні фактори, такі як рН барвника Райт, буфер і промивний розчин; а також час фарбування та фіксації.

Отже, кожен етап підготовки реагентів є вирішальним і повинен бути зроблений з урахуванням кожної деталі.

Матеріали

Розмальовка Райт. Для 100 мл потрібно:

Зважують 0,3 г барвника Райт, вимірюють 97 мл метанолу і 3 мл гліцерину.

Підготовка

У ступці помістіть важку кількість барвника Райта і повільно додайте гліцерин до повного розчинення порошку..

Потім додають метанол, перемішують і виливають у бурштинову пляшку.

Перед використанням розчин слід струшувати з легкими рухами і фільтрувати.

Буферний буфер

В літр дистильованої води, 3,76 г гідрофосфату натрію (Na2HPO4   2H20) плюс 2,1 г дигідрофосфату калію (KH)2PO4).

Змішують дуже добре, поки всі включені реагенти не розчиняються. Відрегулюйте рН до 7,2. Налийте у скляну банку і зберігайте при кімнатній температурі.

Додаткові матеріали, необхідні для виконання фарбування

Крім того, для виконання техніки забарвлення потрібні інші матеріали: листи, що переносять предмети або покриває предмети, місти забарвлення, pisetas з водою або буфером для прання, секундомір для прийняття часу розфарбування і деякий сушильний матеріал (абсорбуюча папір, марля або бавовна).

Компоненти плями Wright

Метанол

Спирт (метанол) служить фіксатором мазка крові на предметне скло.

В основному це відновлювальний реагент, дегидратор і фіксатор коагулянту. Тому його функція полягає в коагуляції білків і їх нерозчинність, але без отримання їх денатурації.

Метанол є найбільш широко використовуваним реагентом для фіксації мазків у всіх лабораторіях, оскільки він забезпечує кращі результати, ніж ті, які отримані з етанолом. Ідеальна концентрація 99%.

Амортизатор

Буфер (буферний розчин) має функцію регулювання або підтримання рН барвника, оскільки рН, встановлений до 7,2, є істотним для клітинних структур для правильного поглинання барвників належним чином.

З іншого боку, проходження фіксації метанолу зневоднює клітини і буфер допомагає їх регідратації.

Eosin (Y)

Еозин має спорідненість до основних компонентів, оскільки він є кислотним барвником. Два типи еозину дуже схожі один на одного, тому будь-який з двох може бути використаний, отримуючи той же результат.

Один з них називається еозином Y, жовтим еозином або тетрабромофлуоресцеином та іншим еозином B, синюшним еритрозином B або дибромодінітрофлуоресцеїном. Однак найбільш часто використовується еозин Y..

Найважливішою властивістю цього барвника є його негативна полярність, що робить її притягнутою клітинними структурами з позитивним зарядом.

Метиленовий синій

Це основний колорит. Її головною властивістю є метахромазія, тобто не всі структури будуть забарвлені в один і той же колір, це залежить від хімічного складу структур, які він забарвлює..

Деякі з них перетворюються на світлі або темно-сині, а інші темно-фіолетові або блідо-бузкові.

Техніка

1 - Здійснюйте розкидання зразка так, щоб залишилася тонка плівка, або на слайді, або на кришці.

2 - Дайте повітря сухому протягом 2 годин.

3 - Помістіть сухий мазок на фарбувальний міст або лоток для фарбування з поширеним вгору зразком.

4 - Покрийте аркуш фарбою крапля за крапкою, поки вона не покриє всю поверхню. Залиште на 5 - 8 хвилин.

5-Барвник повинен повністю покривати слайди, не розливаючись по краях. Якщо під час забарвлення вона починає випаровуватися, необхідно помістити додаткові краплі.

6-Згодом додайте рівну кількість амортизатора, трохи подуйте до появи характерного металевого блиску. Візьміть від 10 до 15 хвилин.

7-Промийте водопровідною водою, розмістивши м'який струмінь, поки лист не стане рожевим.

8-З марлею, просоченої спиртом, видаліть барвник, прикріплений до задньої частини слайда.

9 - Дайте мазку висушитись дуже добре, перш ніж розмістити масляне масло для його візуалізації в мікроскопі.

Утиліта

Гематологія

Він ідеально підходить для розмазування мазків периферичної крові, для вивчення густих мазків крові та для вивчення клітин з зразків кісткового мозку.

Через хімічні властивості цієї комбінації барвників клітинні структури можуть бути легко розпізнані, оскільки вони здатні розрізняти різні типи клітин, що присутні.

Назальна секреція

Ця методика дуже корисна для виявлення клітин носової секреції (епітеліальні клітини, сегментовані еозинофіли, поліморфноядерні) в діагностиці алергічного риніту \ t.

Паразитологія

У цьому сенсі вона була корисною для вивчення Leishmania sp в межах гістіоцитів підшкірної клітинної тканини в шкірних виразках. Також він використовується для виявлення лейкоцитів у зразках калу (фекальний лейкограма).

У цьому випадку для лікаря представляє інтерес знати, чи лейкоцитоз, присутній у фекаліях, є поліморфноядерним або мононуклеарним. Цей висновок у фекальної лейкограми буде направляти, якщо це бактеріальна або вірусна інфекція відповідно.

З іншого боку, паразити, які циркулюють в крові, можуть бути знайдені всередині еритроцита або вільні в плазмі. Розшукуються паразити Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii і філярій, а у ветеринарії корисний при пошуку Theileria equi і Babesia caballi, збудників немовлят, особливо у коней.

Забарвлення Райта і Гімзи може диференціювати гемопаразити від нормальних клітинних компонентів. Для цього можна використовувати два типи розворотів:

Прекрасні ділянки

Кров поширюється, як тонка плівка на слайді. Пофарбовані плямою Райта, виявляючи характеристики ядра і цитоплазми.

Товста крапля

Ця методологія використовується для дослідження наявності паразитів у більшій кількості крові.

Для цього на слайд поміщається велика крапля крові. Потрапивши туди, потрібно дефібринувати, зробивши великі і великі кола від центру назовні, використовуючи край іншого слайда.

Нарешті, для того, щоб спостерігати паразитів в густому мазку, еритроцити повинні бути лизировани водою.

Респіраторні інфекції

На дихальному рівні ця методика також корисна, оскільки клітини, що знаходяться в зразках мокротиння, бронхіальний або бронхоальвеолярний лаваж, важливі для встановлення діагнозу..

Крім того, тут можна виділити поліморфноядерні клітини і мононуклеарні клітини.

Бактеріологія

Застосування цього методу в бактеріології обмежене, тому що воно не є корисним для фарбування бактерій, тому для фарбування їх використовуються інші спеціалізовані методи фарбування..

Проте він використовувався для пошуку епітеліальних клітин з тілами включення Chlamydia trachomatis в мазках уретральної або ендоцервікальної слизової оболонки, хоча слід визнати, що це не найкращий метод для.

Також можна спостерігати спіральні бактерії серед еритроцитів, як Borrelia burgdorferi у інфікованих пацієнтів, а також в морулах або тілах включення Ehrlichia sp в цитоплазмі лімфоцитів, моноцитів або нейтрофілів в мазці крові.

Мікологія

The Histoplasma capsulatum є патогенним грибом, який часто діагностується шляхом мікроскопічного спостереження різних зразків тканин, забарвлених плямою Райта.

Як спостерігаються структури зразка крові з плямою Райта?

Рекомендації для хорошого фарбування

Розширення зразків крові слід спонтанно сушити на повітрі. Мазки повинні бути настільки тонкими, наскільки це можливо, щоб отримати кращу фіксацію барвника і уникнути надмірного поглинання.

Для високоякісного фарбування доцільно проводити фарбування протягом двох годин після приготування мазка. З іншого боку, ідеальним зразком є ​​капілярна кров, без антикоагулянта.

Однак, якщо використовується венозна кров, її слід використовувати як антикоагулянт ЕДТА, а не як гепарин, оскільки останні можуть деформувати клітинні структури.

Для запобігання зносу готового барвника слід зберігати в сухих місцях.

Під час процесу прання рекомендується використовувати воду, доведену до нейтрального pH.

Нарешті, доцільно тестувати методи фарбування, які часто використовуються в лабораторії.

Це робиться шляхом фарбування зразків або розширених моделей, як контроль якості. Цей етап є важливим, оскільки це гарантує, що фарбування правильно підготовлено, і час забарвлення добре стандартизовано.

Якщо шаблон листа погано пофарбований, то виникають проблеми, які необхідно вирішити.

Поширені помилки в кольорі Wrigth

Дуже блідий фарбування

Дуже бліді мазки, як правило, через дуже короткий час фарбування або дуже перебільшене промивання. Це коригується шляхом подовження часу контакту з барвником або зменшенням часу прання.

Осад виділяється барвником

Наявність барвника в мазку може мати декілька причин, однак найбільш частими причинами є: використання нефільтрованого барвника, фарбування на нерівномірних фарбувальних мостах, використання брудних аркушів пилом або жиром, що не роблять добре промивання Закінчити фарбування.

Мазок з надзвичайно червоною або блакитною забарвленням

Буфер відповідає за рН барвника. Барвники з рН нижче зазначеної (кислоти) призводять до дуже червоних мазків.

Якщо рН барвника перевищує (лужний), то буде отримано надзвичайно синюватий мазок.

Режим зберігання

Реагент слід зберігати при кімнатній температурі.

Список літератури

  1. Gutiérrez V. Порівняльне дослідження методу фарбування Райта та тесту Elisa для діагностики Ehrlichiosis canina у місті Сан-Педро-Сула, Гондурас. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора ветеринарної медицини. Університет Сан-Карлос-де-Гватемала.
  2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Базове фарбування в лабораторії мікробіології. Дослідження інвалідності. 2014; 3 (1): 10-18.
  3. "Пляма Райта". Вікіпедія, Вільна енциклопедія. 18 травня 2018, 12:05 UTC. 8 грудня 2018, 20:37
  4. Calderón A, Кардона J, Вергара. Частота Babesia spp. в конях montería, Кордова (Колумбія). Об'яв.  2013 рік; 16 (2): 451-458.
  5. Forbes B, Sahm D, Вайсфельд A (2009). Мікробіологічна діагностика Bailey & Scott. 12 ed. Аргентина Panamericana S.A Редакція.
  6. Retamales E, Mazo V. Інститут громадського здоров'я Уряд Чилі. Рекомендації щодо фарбування мазків крові для зчитування показників крові.